SNP芯片
2017年3月9日
外泌体microRNA测序
2017年3月9日

外泌体circRNA测序

外泌体(Exosome)是由包括肿瘤细胞在内的几乎所有类型的细胞都可以产生并释放的一种微囊,其内部包裹了DNA,RNA,蛋白等物质。众多的研究表明,外泌体在血液,乳汁,尿液等体液内传播,其内容物如miRNA可被其他细胞吞噬,成为细胞间通讯的重要介质。越来越多的证据表明,宿主细胞或肿瘤细胞分泌的外泌体参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移。外泌体上述特征和生物学功能,使其成为液体活检领域的重要研究对象。

环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类特殊的非编码RNA,其具有很多重要的调控功能。circRNA可作为竞争性内源RNA(ceRNA)结合胞内miRNA阻断miRNA对其靶基因的抑制作用,还可调控其他类型RNA、调节蛋白质活性等。circRNA的环状结构对RNase不敏感,导致它比线性RNA更为稳定,这些特性使得circRNA具有开发疾病新型诊断与治疗方法的巨大潜力。

技术优势

  • 高精确度

数字化信号,可预测到基因家族中相似基因以及不同可变剪切类型产生的circRNA序列信息

  • 高覆盖度

新一代高通量测序技术的高深度覆盖,可以检测到低丰度的稀有circRNA

应用方向

  • 流程

 

  • 生信分析

 

  • 产品参数
产品类型 平台 推荐数据量 周期
外泌体microRNA测序 HiSeq X (PE 2*150) 8G 45天

样本种类 单个样本量
人血清/血浆 2 mL-4 mL

 

1、样本数据统计

样本 Exp Con
文件名称 Exp_R1.fastq Exp_R2.fastq Con_R1.fastq Con_R2.fastq
文件类型 Conventional base calls Conventional base calls Conventional base calls Conventional base calls
Encoding Sanger / Illumina 1.9 Sanger / Illumina 1.9 Sanger / Illumina 1.9 Sanger / Illumina 1.9
总序列数量(条) 68500982 68500982 70349962 70349962
低质量序列(条) 0 0 0 0
序列长度(bp) 150 150 150 150
GC含量(%) 53 53 52 52

2、测序数据质量评估

测序数据质量评估内容包括:单碱基序列质量、序列质量分数、序列GC含量、序列长度分布。

A、单碱基序列质量:如果一条reads在某位置出错概率p=0.01时,图上纵坐标的值就是-10*log10(p)=20,红色表示中位数,黄色是25%-75%区间,触须是10%-90%区间,蓝线是平均数。

B、序列质量分数:横轴为质量,质量=-10*log10(p),其中p是一条reads在某位置出错概率;纵轴是reads数目。当峰值为27时代表错误率为0.2%,当峰值为20时代表错误率为1%)。

C、序列GC含量:红线是实际情况,蓝线是理论分布(正态分布,均值不一定在50%,而是由平均GC含量推断的)。

D、序列长度分布情况:横轴表示序列读长,纵轴表示序列数量。序列长度分布应该与测序理论值一致。

3、基础分析

基础分析包括:circRNA表达数据分析、circRNA差异表达分析、聚类分析

 

4、高级网络分析

高级网络分析包括:microRNA与circRNA调控网络(microRNA-circRNA-Network)、circRNA与基因共表达网络(circRNA-mRNA-network)、ceRNA调控分析转录因子调控网络(TF- circRNA -Network)。

A、ceRNA调控网络分析:描述circRNA、miRNA、mRNA三者之间的相互调控关系。

B、circRNA与基因共表达网络(circRNA-mRNA-network):根据circRNA和基因在样本中的表达值构建circRNA与基因之间共表达网络,能发现circRNA所调控的靶基因。

C、转录因子调控网络(TF-circRNA-Network):展现调控目标circRNA的转录因子。

D、miRNA与circRNA调控网络:根据miRNA与circRNA靶向结合关系所构建的互相调控网络,能发现调控能力最强的circRNA以及其对应的靶向miRNA。

案例一

题目:

外泌体中稳定存在的circRNA可作为疾病诊断的潜在标志物(Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis)

研究背景:

外泌体是体内细胞以非出芽的形式形成的由脂质双分子层包裹的纳米级胞外小泡,几乎所有的细胞均可主动分泌。外泌体能够有效地将所携带的具有生物活性的蛋白质、脂质以及合算运输至不同的受体细胞,从而改变受体细胞的生物活动。目前,多个研究表明外泌体参与了肿瘤的形成、耐药以及转移等多个肿瘤相关进程。circRNA是区别于传统线性RNA的一类新型RNA,具有闭合环状结构,大量存在于真核转录组中。大部分的环状RNA是由外显子序列构成,由于环状RNA对核酸酶不敏感,所以比线性RNA更为稳定。环状RNA在细胞内可以竞争性结合miRNA,从而调控miRNA靶基因的表达。

研究方法:

结论:

1、 CircRNA表达丰度
作者通过RNA-seq检测了从MHCC-LM3肝癌细胞和外泌体中提取的RNA(去除核糖体RNA),分别发现了5484个和6751个circRNA。作者将外泌体来源的circRNA称为exo-circRNA。通过比较两组来源的circRNA的表达丰度,作者发现外泌体中含有更多的circRNA。接着,通过qRT-PCR的方式验证了部分circRNA在两种来源中的表达量,4/7 的circRNA得到了验证。

而且,通过计算circRNA与线性RNA的比例(back-spliced ratio),作者发现在外泌体中该比例比在细胞种高6倍,表明进入外泌体的circRNA比线性RNA更多。接着,作者利用多种癌症的细胞系qRT-PCR分析,发现外泌体中能够富集更多的circRNA是一个普遍的现象。

2、 circRNA与miRNA

据研究发现miRNA在外泌体中十分丰富,circRNA可以通过结合miRNA来参与基因的表达和调控,例如CDR1as可以结合miR-7来参与生物进程。随着HEK293T细胞中miR-7含量的增加(转染miR-7的模拟物),作者发现CDR1as的含量在外泌体中显著下调,而在细胞来源的CDR1as则改变很少(图7 A)。在SMCC-7721细胞系的实验中,作者发现CDR1as环状RNA可以有效地阻断由miR-7介导的生长抑制进程(图7 B)。这些研究表明,通过改变来源细胞相关的miRNA的水平可以调节某些circRNA在外泌体中富集程度。

3、 血液外泌体的circRNA

许多细胞都会分泌外泌体,除了细胞来源的外泌体中含有大量稳定存在的circRNA以外,作者发现在健康人的血清外泌体中也存在着大量且结构稳定的circRNA。通过对1215个血清外泌体中的circRNA的研究,作者发现绝大多数的circRNA的序列并不是很长(不超过1000nt),且含有蛋白编码外显子(图8 A 和 B)。circRNA由于其环状的结构,使得其具有较好的稳定性(图9)。这些结果表明在血清外泌体中稳定存在的circRNAs可能参与调控生物过程,并且可能作为疾病诊断的靶标。

4、 circRNA与疾病

为了进一步研究circRNA是否可以成为疾病诊断的靶标,作者建立了一个小鼠肿瘤模型,并且在实验组小鼠的血清外泌体汇总发现了人类的环状RNA CDYL。进一步研究circ-CDYL与肿瘤大小的关系,作者发现circ-CDYL的表达量与肿瘤质量成正比。接着,作者发现直肠癌病人与健康人群血清外泌体circRNA的表达谱具有显著差异,其中绝大多数的circRNA可以同时存在于健康人群和直肠癌病人的血清外泌体中。circ-KLDHC10在CRC病人血清外泌体中的表达量远远高于健康人群血清外泌体中的表达,该发现进一步说明肿瘤来源的exo-circRNA可以作为临床癌症诊断的标志物。

参考文献:

Li Y, Zheng Q, Bao C, Li S, Guo W, Zhao J, et al. Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis. Cell research 2015;25:981.

常见问题

1如果需要从血浆中分离外泌体,可以使用肝素或EDTA管去收集血液样本吗?
不可以。肝素将会大大损害接下来的RNA实验。EDTA也许会干扰PCR 实验。使用无肝素无EDTA管去收集血液样本。立即离心样品收集血浆用于exosome分离。如果必须使用抗凝剂,用EDTA管收集血液。如果有必要的话在接下来的PCR反应中调整Mg++的浓度。
2细胞培养过程中的死细胞是否会影响exosome的分析?
会的。在收获细胞时,应确定死亡细胞占所有细胞5%以下。细胞死亡过程中会释放大量大小不等的囊泡,细胞最终会裂成碎片,它们在exosome的纯化过程中会污染活细胞产生的exosome。
3样品在exosome 提取前是否可以冻存?
可以。血样、尿样、体液等,需要攒齐了一起提取,或者同一个患者的样本多次提取。冻存前,首先要离心去除细胞和血小板,再将样品分装冻存于-20或-80℃。但如果有条件最好还是用新鲜样品立即进行提取。
4exosome 提取后是否可以冻存?
可以。使用硅化E.P.管或冻存管,减少exosome的粘附。Exosome能够承受反复冻融,但我们仍建议分装,避免多次反复冻融。对于一些功能性实验,建议不要冻存,直接使用新鲜提取或保存在4℃悬浮于PBS 中的exosome。

 

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