外泌体circRNA测序
2017年3月9日
血清血浆microRNA测序
2017年3月9日

外泌体microRNA测序

外泌体(Exosome)是由包括肿瘤细胞在内的几乎所有类型的细胞都可以产生并释放的一种微囊,其内部包裹了DNA,RNA,蛋白等物质。众多的研究表明,外泌体在血液,乳汁,尿液等体液内传播,其内容物如miRNA可被其他细胞吞噬,成为细胞间通讯的重要介质。越来越多的证据表明,宿主细胞或肿瘤细胞分泌的外泌体参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移。

外泌体上述特征和生物学功能,使其成为液体活检领域的重要研究对象,其明生物依托丰富的RNA项目经验和领先的生信分析实力,推出了针对外泌体miRNA研究的系统解决方案,将协助科研人员深度开展外泌体miRNA的调控功能研究。

 

应用方向

  • 流程

 

  • 生信分析

 

  • 产品参数
产品类型 平台 推荐数据量 周期
外泌体microRNA测序 HiSeq X (PE 2*150) 8G 45天

样本种类 单个样本量
人血清/血浆 2 mL-4 mL

 

案例一

题目:类泛素化hnRNPA2B1通过结合miRNA特异基座来调控其装载到外泌体

研究背景:

外泌体是细胞分泌到胞外基质参与细胞间信号转导的物质。外泌体中mRNA,microRNA和lncRNA有特殊的组成形式能够将信号转移到受体细胞。然而,细胞调控这些RNA装载到外泌体中的机制尚不明确。本文作者描述了miRNA中的序列基序能够调控外泌体中RNA的定位。异质性核糖核蛋白A2B1(hnRNPA2B1)能够通过识别这些基序,特异性结合胞浆中的miRNAs并把他们装载到外泌体中。而且hnRNPA2B1是类泛素化(SUMO化),类泛素化调控miRNA与hnRNPA2B1的结合。基序发生突变和hnRNPA2B1的表达水平变化会调控miRNA装载到外泌体。以上发现证明hnRNPA2B1在miRNA装载到外泌体中发挥着重要的作用,应用到生物医学中可能成为装载特定调控RNA到外泌体的工具。

研究结果:

1、外泌体中的miRNA具有特异性

为了证实一些RNA是被特异性组装进入外泌体的,我们利用原代T淋巴母细胞及其外泌体进行了芯片检测并分析了其中miRNA和mRNA的活化诱发的变化。结果显示,大对数情况下miRNA调节后的活化在细胞和外泌体中表现不一致。在T细胞活化后表达量上升的miRNA在外泌体中没有显著的增加,mRNA也有相似的现象。在细胞和外泌体中激活调控miRNA和mRNA缺乏一致性,推测miRNA和mRNA装载到外泌体可能不是一个被动过程。不管是静息或活化状态,外泌体中数个miRNA的丰度要高于细胞中,大部分miRNA在细胞的中的含量要高于外泌体。这证明一些miRNA是被特异装载进入外泌体中。

2、外泌体中存在基序调控RNA装载到外泌体

为了研究序列的不同,作者利用了多重比对(ClustalW)分析了30个成熟的外泌体miRNA和42个细胞中miRNA。这些miRNA是在原代T细胞和白血病Jurkat T细胞的细胞和外泌体中都存在差异表达。联合进化分支图按照成熟的miRNA进入细胞或外泌体的趋势进行分组(蓝色表示细胞内miRNA,红色表示外泌体miRNA)。同源miRNA(拥有相似序列但是在不同的染色体上)也表现出相似的分配趋势。相反的由同一个miRNA前体形成的互补链上的成熟miRNA,虽然在表达水平上相似,但是序列不同,所以分配到外泌体或细胞中的趋势也有不同。以上结果显示miRNA的序列是决定装载到外泌体的关键因素。经过无偏向性分析,作者找出了2个在外泌体miRNA中高丰度的基座(motif),3个在细胞miRNA中高丰度的基座。

为了验证这些motif对miRNA装载的影响,作者利用逆转录病毒载体克隆了细胞中的miRNA(miR-17)和外泌体中的miRNA(miR-601),然后观察到miR-17的序列突变后转换成了外泌体miRNA,相反,突变后的miR-601转换为细胞miRNA。将miR-17的细胞motif转换为外泌体motif会导致EXO/CL比例升高。以上数据表明miRNA中特异性短motifs决定了它们是否会装载到外泌体中。

3、hnRNPA2B1调控miRNA转载到外泌体

为了研究特异miRNA分泌到外泌体的分子机制,利用蛋白质pull-down实验和质谱分析获取了miR-198(EXOmiRNA)和miR-17(CLmiRNA)结合的蛋白质。对沉淀出的蛋白质进行功能分析,结果显示主要的生物学功能是与RNA转录后修饰相关。这些蛋白质中包括了异质核糖核蛋白(hnRNPs),其中hnRNPA2B1 和 nRNPA1似乎只结合外泌体miRNA。hnRNPA2B1是一种普遍存在的蛋白质,而且其编码RNA在神经元中的转运调控是通过结合21nt的RNA转运序列实现的,这段序列也包含了EXOmotifs,所以我们选择hnRNPA2B1作为候选研究蛋白。首先利用了蛋白质印迹(western blot)检测了外泌体中hnRNPA2B1的含量,流式细胞仪分选的结果显示hnRNPA2B1的荧光信号在渗透化外泌体中高于非渗透化外泌体中,说明蛋白主要是存在与外泌体中。然后利用免疫沉淀反应证实了外泌体裂解液中hnRNPA2B1和miRNA-198的结合,利用电泳迁移率改变分析验证了hnRNPA2B1和miRNA-198的结合的特异性。为了验证hnRNPA2B1在外泌体中miRNA的装载作用,作者在Jurkat T细胞中沉默hnRNPA2B1能够显著降低外泌体中miR-198的表达水平;相反的,过表达hnRNPA2B1能够增高miR-198的水平但是不会改变miR-18a的表达。

4、hnRNPA2B1的类泛素化调控了miRNA的装载

蛋白质印迹分析显示外泌体中的hnRNPA2B1和hnRNPA1的分子量比细胞中的要高,说明这些蛋白在外泌体中发生过翻译后修饰。hnRNPA1一类蛋白通常会通过与泛素结合的方式而被修饰物,通过实验也确实证实了外泌体中的hnRNPA2B1和hnRNPA1的分子量变化与被泛素化后的分子量一致。为了验证外泌体中hnRNPA2B1的高分子量是因为类泛素化,作者在培养Jurkat T细胞时加入了类泛素特异抑制剂漆树酸(AA),结果显示未处理的外泌体中仅含有少量的低分子量的hnRNPA2B1,在加入漆树酸后,低分子量的很容易被检测到。结果表明,外泌体中高分子量的hnRNPA2B1是因为类泛素化作用,类泛素化的hnRNPA2B1能更好的分选进入外泌体。进一步分析显示,漆树酸处理后外泌体中miR-198的水平降低,miR-17和miR-18的水平没有改变;而且当类泛素化被抑制时,与hnRNPA2B1结合的miR-198也会变少,外泌体分泌和细胞凋亡未见变化。以上研究表明,hnRNPA2B1介导的外泌体miRNA装载是受蛋白质的类泛素化调控的。

参考文献:

Villarroya-Beltri C, Gutierrez-Vazquez C, Sanchez-Cabo F, Perez-Hernandez D, Vazquez J, Martin-Cofreces N, et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nature communications 2013;4:2980.

常见问题

1如果需要从血浆中分离外泌体,可以使用肝素或EDTA管去收集血液样本吗?
不可以。肝素将会大大损害接下来的RNA实验。EDTA也许会干扰PCR 实验。使用无肝素无EDTA管去收集血液样本。立即离心样品收集血浆用于exosome分离。如果必须使用抗凝剂,用EDTA管收集血液。如果有必要的话在接下来的PCR反应中调整Mg++的浓度。
2细胞培养过程中的死细胞是否会影响exosome的分析?
会的。在收获细胞时,应确定死亡细胞占所有细胞5%以下。细胞死亡过程中会释放大量大小不等的囊泡,细胞最终会裂成碎片,它们在exosome的纯化过程中会污染活细胞产生的exosome。
3样品在exosome 提取前是否可以冻存?
可以。血样、尿样、体液等,需要攒齐了一起提取,或者同一个患者的样本多次提取。冻存前,首先要离心去除细胞和血小板,再将样品分装冻存于-20或-80℃。但如果有条件最好还是用新鲜样品立即进行提取。
4exosome提取后是否可以冻存?
可以。使用硅化E.P.管或冻存管,减少exosome的粘附。Exosome能够承受反复冻融,但我们仍建议分装,避免多次反复冻融。对于一些功能性实验,建议不要冻存,直接使用新鲜提取或保存在4℃悬浮于PBS 中的exosome。

 

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