血清血浆microRNA测序

外泌体microRNA测序
2017年3月9日
外泌体lncRNA&mRNA测序
2017年3月9日

血清血浆microRNA测序

Small RNA是生物体内一类重要的调控分子,参与细胞生长、发育、代谢、基因转录和翻译等诸多生物学过程,在疾病的发生发展转归的病理过程中也具有非常重要的作用,是一类新的极具开发潜质的生物标志物和药物靶标。Small RNA是一大类调控分子,几乎存在于所有的生物体中,Small RNA包括:miRNA、ncRNA、siRNA、snoRNA、piRNA、rasiRNA等。

Small RNA(sRNA)测序采用Illumina HiSeq平台,可针对样本中的miRNA、siRNA、piRNA展开全面分析,既能鉴定已知sRNA、也能预测新的sRNA并预测sRNA的靶基因,为研究small RNA功能及调控机制提供有力手段。

技术优势

  • 高度开放性

无需预先了解序列信息和二级结构,即可研究任一物种已知的小RNA分子和预测新的小RNA分子。

  • 高度灵活性

可研究任一17~35nt之间小RNA分子。

  • 高度精确性

可精确到单核苷酸水平,非常有利于区分高度同源的小RNA分子和鉴定小RNA的多态性。

  • 检测动力学范围广

可在超过6个数量级范围内实现准确的序列检测和定量分析,有利于低丰度小RNA差异表达的研究。

  • 保持链特异性信息

保留了小RNA的原始链定位信息,有利于研究小RNA的表达调控机理。

  • 数据质量高

深度测序保证了抽样随机性,可靠性和重复性高,与实时定量PCR结果具有较高的一致性。

应用方向

 

  • 流程

 

  • 生信分析

 

  • 产品参数
产品类型 平台 推荐数据量 周期
Small RNA测序 HiSeq 2500 Rapid SE 1*50 10M clean data 45天

样本种类 单个样本量 注意事项
RNA ≥3 ug 浓度:>250 ng/uL

纯度:OD(260/280)=1.8~2.0

OD(260/230)≥2.0

常见问题

1small RNA分析需不需要参考基因组?
 需要,因为新miRNA的预测必须要通过其前体形成的二级结构进行分析,没有参考基因组,则无法知道其前体可能的二级结构。或者,退而求其次的办法,至少需要提供相应的参考转录组信息,以转录本作为参考序列用于small RNA的分析。
2small 如何验证miRNA的表达量?
 设计miRNA专门的发夹状反转录引物,定量PCR验证其表达量。
3small 所有的物种small RNA都主要分布在20-24个碱基吗?
 不是,这取决于物种和样品特性,有些样品就会在30nt左右表现出高丰度。
4small 已知miRNA分析中,样品的首位及各位碱基的偏好性统计图可以说明什么?
miRNA前体发育为成熟体的过程是由Dicer酶酶切完成,酶切位点的特异性使得miRNA成熟体序列首位碱基对U具有很强的偏向性,而对G却排斥,但第二到四位缺乏U,一般来讲,除第四个碱基外,其他位置通常都缺乏C。
5small RNA测序完成后如何进行实验验证?

sRNA后续实验验证的方法有很多:

1.qPCR,验证microRNA的表达;

2.RIP-seq,通过RIP技术富集得到具有甲基化修饰的RNA或与目的蛋白特异结合的RNA, 对富集得到的RNA进行高通量测序,与基因组进行比对分析,获得microRNA上与目的蛋白特异结合的位置信息等;

3.荧光素酶报告系统;

4.过表达载体的构建或目的基因的敲除。

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