外泌体lncRNA&mRNA测序

血清血浆microRNA测序
2017年3月9日
lncRNA&mRNA测序
2017年3月9日

外泌体lncRNA&mRNA测序

外泌体(Exosome)是由包括肿瘤细胞在内的几乎所有类型的细胞都可以产生并释放的一种微囊,其内部包裹了DNA,RNA,蛋白等物质。众多的研究表明,外泌体在血液,乳汁,尿液等体液内传播,越来越多的证据表明,宿主细胞或肿瘤细胞分泌的外泌体参与了肿瘤发生、生长、侵袭和转移。

外泌体上述特征和生物学功能,使其成为液体活检领域的重要研究对象,利用转录组高通量测序技术可以同时检测其所含RNA分子如lncRNA,mRNA,对外泌体mRNA、lncRNA等的鉴定和调控功能进行研究。

应用方向

  • 流程

 

  • 生信分析

 

  • 产品参数
产品类型 平台 推荐数据量 周期
mRNA测序 HiSeq X (PE 2*150)
lncRNA测序 HiSeq X (PE 2*150) 8G 45天

样本种类 单个样本量
人血清/血浆 2 mL-4 mL

1、样本数据统计

样本 Exp Con
文件名称 Exp_R1.fastq Exp_R2.fastq Con_R1.fastq Con_R2.fastq
文件类型 Conventional base calls Conventional base calls Conventional base calls Conventional base calls
Encoding Sanger / Illumina 1.9 Sanger / Illumina 1.9 Sanger / Illumina 1.9 Sanger / Illumina 1.9
总序列数量(条) 68500982 68500982 70349962 70349962
低质量序列(条) 0 0 0 0
序列长度(bp) 150 150 150 150
GC含量(%) 53 53 52 52

2、测序数据质量评估

测序数据质量评估内容包括:单碱基序列质量、序列质量分数、序列GC含量、序列长度分布。

A、单碱基序列质量:如果一条reads在某位置出错概率p=0.01时,图上纵坐标的值就是-10*log10(p)=20,红色表示中位数,黄色是25%-75%区间,触须是10%-90%区间,蓝线是平均数。

B、序列质量分数:横轴为质量,质量=-10*log10(p),其中p是一条reads在某位置出错概率;纵轴是reads数目。当峰值为27时代表错误率为0.2%,当峰值为20时代表错误率为1%)。

C、序列GC含量:红线是实际情况,蓝线是理论分布(正态分布,均值不一定在50%,而是由平均GC含量推断的)。

D、序列长度分布情况:横轴表示序列读长,纵轴表示序列数量。序列长度分布应该与测序理论值一致。

3、基础分析

基础分析包括:基因表达数据分析、聚类分析、转录本表达数据分析、转录本类型统计、差异基因功能分析、差异基因信号通路分析。

4、高级网络分析

高级网络分析包括:信号通路互作网络(Path-Net)、基因间信号转导网络(signal-Net)、基因共表达网络(coexpression-Net)、转录因子调控网络(TF-Gene-Network)。

A、信号通路互作网络(Path-Net):描述信号通路与信号通路之间的上下游关系,能从网络中退出信号起始通路和效应通路。

B、基因间信号转导网络(signal-Net):展示基因间已被证实的上下游调控关系。

C、基因共表达网络(coexpression-Net):根据基因表达值构建基因与基因之间共表达网络,能发现新的基因之间的调控关系。

D、转录因子调控网络(TF-Gene-Network):展现调控目标基因的转录因子。

案例一

题目:

外泌体中lncARSR作为一种内源竞争性RNA诱发肾癌细胞对舒尼替尼耐药(Exosome-Transmitted lncARSR Promotes Sunitinib Resistance in Renal Cancer by Acting as a Competing Endogenous RNA)

研究背景:

肾细胞癌(RCC)在世界范围内的发病率一直在上升,近20%的RCC患者在诊断时已是晚期,而且局部肾癌中约30%的患者在手术切除后会复发和转移。目前治疗晚期RCC患者的主要治疗方法是用舒尼替尼,它是一种口服的多靶点的酪氨酸激酶受体(RTK)抑制剂,可以通过抑制血管内皮生长因子受体(VEGFR),血小板源生长因子受体(PDGFR)和FMS样酪氨酸激酶3有效的达到抗血管生成和抗肿瘤的作用。然而近年来一些报道称10%-20%晚期RCC患者对舒尼替尼产生了耐药,所以当前临床上也迫切需求了解舒尼替尼耐药的潜在作用机制并开发出有效的治疗策略。

外泌体是一种来源于多泡体(MVBs)的粒径在70-120nm的细胞囊泡,可以通过囊泡与细胞膜融合后释放到细胞质基质中。人体内多种细胞及体液均可分泌外泌体,外泌体可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等来调节受体细胞的生物学活性。最近研究表明,基质细胞的外泌体能通过传递蛋白质和miRNAs来影响治疗反应。然而虽然耐药癌细胞分泌的外泌体是否能将耐药信息传递给敏感细胞还有待验证,但是循环外泌体或许更易成为评估患者耐药的分子标志物。
长链非编码RNA(lncRNA)一类长度大于200bp不编码蛋白质的RNA,主要功能包括调控基因表达和转录的调控,与miRNAs,mRNAs,或蛋白作用参与转录后调控。新的研究表明lncRNA能够调节癌症的印记包括增殖,细胞凋亡,转移和代谢。但是lncRNA在舒尼替尼耐药中的机制尚未明确。

舒尼替尼耐药性是晚期肾细胞癌治疗的一个主要挑战,在临床上也迫切需求了解舒尼替尼耐药的潜在机制和开发出有效的治疗策略。本文中我们发现了一个长链非编码RNA-lncARSR(在肾细胞癌舒尼替尼耐药中活化状态)与临床不良的舒尼替尼耐药相关。lncARSR能够通过竞争结合miR-34/miR-449来促进肾细胞癌细胞中AXL和c-MET的表达,从而促进了舒尼替尼耐药。并且,具有生物活性的lncARSR能够并入外泌体中传递到敏感细胞从而传播舒尼替尼耐药性。在肾细胞癌中采用靶向lncARSR锁核酸技术或者AXL/c-MET抑制剂来恢复舒尼替尼的反应。因此,lncARSR可能会成为舒尼替尼耐药的一个预测因子或潜在的治疗靶点。

结论:

1、在舒尼替尼耐药的RCC细胞中lncARSR高表达

利用lncRNA芯片检测亲代细胞和耐药细胞的lncRNA表达,从聚类图中可看出两组之间差异明显,然后选取差异倍数大于5的共67个lncRNA进行了qRT-PCR验证。第一轮实验验证得到了24个lncRNA,其中8个lncRNAs在患者的移植瘤(PDXs)中高表达且对舒尼替尼反应很弱。进一步将这8个lncRNA通过干扰技术在耐药RCC细胞中进行了功能缺失分析,结果显示干扰lncRNA RP11-375O18.2-001 (Ensembl: ENST00000424980)能够抑制舒尼替尼的耐药,并将其命名为lncARSR,同是利用印迹杂交分析在舒尼替尼耐药细胞中检测到lncARSR的高表达。

2、 lncARSR在舒尼替尼耐药的RCC细胞受AKT/FOXO轴调控

利用生物信息分析预测得到在lncARSR的启动子区域(上游2000bp到下游20bp)与FOXO1和 FOXO3a的三个DNA结合元件(DBEs)。在舒尼替尼耐药细胞中转染活化的FOXO1或FOXO3a能够显著降低lncARSR的表达水平。但是DNA结合区域的缺失突变体对lncARSR表达没有影响。组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A和丁酸钠处理能够解除FOXO1/FOXO3a对lncARSR的抑制作用,以上证据推测FOXO1和FOXO3a是通过招募组蛋白去乙酰化酶发挥转录抑制作用。

3、 lncARSR在舒尼替尼耐药的RCC中是必须的

为了进一步验证lncARSR的功能,我们通过慢病毒转染敲除lncARSR后,耐药细胞能有效的抑制STAT3,AKT和ERK信号通路,增加poly聚合酶分裂。这表明抑制lncARSR能够恢复耐药细胞对舒尼替尼的反应。在7Su3rd 移植瘤中敲除lncARSR后也能显著增加药物敏感,且在4个月后仍无复发。

4、血浆和肿瘤组织中lncARSR的水平与舒尼替尼耐药相关

和正常人相比,RCC患者的血浆lncARSR水平是升高的,在肿瘤切除后会降低,但是肿瘤复发后再次升高,由此推测血浆lncARSR是由肿瘤细胞产生的。和舒尼替尼耐药细胞中的检测结果一致,在耐药细胞的CM中检测到的lncARSR水平也显著高于亲代细胞。利用Kaplan-Meier分析得到治疗前血浆中高水平的lncARSR与降低舒尼替尼治疗RCC治疗患者的无进展生存期相关。这种相关性在转移环境中更加显著。目前lncARSR在舒尼替尼治疗前表达的高低在临床特征上没有显著差异。Cox回归分析进一步证明了治疗前血浆高水平的lncARSR是舒尼替尼治疗RCC患者的一个独立的预后因子。同样我们在肿瘤组织总也的到了相似的结论。

5、lncARSR通过外泌体在细胞间的传递舒尼替尼耐药性

利用核糖核酸酶处理CM,其中的lncARSR水平没有变化,同是用Triton X100处理,则会显著下降,这证明细胞外lncARSR主要是有膜包裹的。利用外泌体标志物TSG101和CD9来判定CM中纯化的外泌体。有趣的是外泌体中lncARSR的含量与与整个CM中几乎相等,显示外泌体是细胞外lncARSR的主要载体。同时,舒尼替尼耐药细胞和亲代细胞分离的外泌体显示出相似的形态,大小和数量。耐药RCC细胞中外泌体lncARSR的水平要显著高于亲代细胞。

6、lncARSR通过内源竞争性结合RNA机制结合miR-34和miR-449来促进AXL和c-MET的表达。

因为lncARSR主要存在于细胞质中,因此它可能内源性竞争结合RNA行使功能。为了验证这一假设,我们首先通过转染786-O细胞阻断其miRNA的生物合成,结果显示,当Dicer酶被敲除后会阻断lncARSR对AXL和c-Met的上调作用。在786-O细胞中过表达lncARSR能够降低AXL和c-Met转录本的富集。平行的,在7Su3rd细胞中敲除lncARSR会引发AXL和c-MET显著的富集。

参考文献:

Qu L, Ding J, Chen C, Wu ZJ, Liu B, Gao Y, et al. Exosome-Transmitted lncARSR Promotes Sunitinib Resistance in Renal Cancer by Acting as a Competing Endogenous RNA. Cancer cell 2016;29:653.

 

 

案例二

题目:

前列腺癌细胞分泌的外泌体中的lncRNAs富含miRNA结合的种子序列(Long non-coding RNAs harboring miRNA seed regions are enriched in prostate cancer exosomes)

研究背景:

长链非编码RNA(lncRNAs)是基因转录产物中最大的一类。这些lncRNA不仅存在于细胞中,同时也存在于细胞来源的细胞外囊泡,如外泌体中。这些lncRNAs在癌症生物学中的功能尚不完全清楚,但他们可以调节基因表达。故,来自悉尼科技大学的研究人员在最新一项研究中分析了几组前列腺癌的外泌体和其亲代细胞系的lncRNAs表达情况,以分析其在癌症癌变过程中的作用。

研究方法:

结论:

研究发现,不同肿瘤细胞系来源外泌体均富含某些lncRNAs。这些外泌体lncRNAs本身富含miRNA种子序列,包括let-7家族成员以及的miR-17,miR-18A,miR-20a,miR-93和miR-106b。并且在外泌体中同时伴随相同的miRNAs的高表达。此外,外泌体lncRNAs也含有RNA结合蛋白的结合序列。最常见的两种基序是ELAVL1和RBMX。鉴于外泌体lncRNAs富含miRNA种子序列与RBP部位,其相互作用可能会在前列腺癌癌变过程中发挥重要功能。

参考文献:

Ahadi A, Brennan S, Kennedy PJ, Hutvagner G, Tran N. Long non-coding RNAs harboring miRNA seed regions are enriched in prostate cancer exosomes. Scientific reports 2016;6:24922.

常见问题

1如果需要从血浆中分离外泌体,可以使用肝素或EDTA管去收集血液样本吗?
不可以。肝素将会大大损害接下来的RNA实验。EDTA也许会干扰PCR 实验。使用无肝素无EDTA管去收集血液样本。立即离心样品收集血浆用于exosome分离。如果必须使用抗凝剂,用EDTA管收集血液。如果有必要的话在接下来的PCR反应中调整Mg++的浓度。
2细胞培养过程中的死细胞是否会影响外泌体的分析?
会的。在收获细胞时,应确定死亡细胞占所有细胞5%以下。细胞死亡过程中会释放大量大小不等的囊泡,细胞最终会裂成碎片,它们在exosome的纯化过程中会污染活细胞产生的exosome。
3样品在exosome (外泌体)提取前是否可以冻存?
可以。血样、尿样、体液等,需要攒齐了一起提取,或者同一个患者的样本多次提取。冻存前,首先要离心去除细胞和血小板,再将样品分装冻存于-20或-80℃。但如果有条件最好还是用新鲜样品立即进行提取。
4exosome(外泌体)提取后是否可以冻存?
可以。使用硅化E.P.管或冻存管,减少exosome的粘附。Exosome能够承受反复冻融,但我们仍建议分装,避免多次反复冻融。对于一些功能性实验,建议不要冻存,直接使用新鲜提取或保存在4℃悬浮于PBS 中的exosome。

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