外泌体lncRNA&mRNA测序
2017年3月9日
mRNA测序
2017年3月9日

lncRNA&mRNA测序

长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)是一类长度超过200 nt的长链非编码RNA,通过与DNA、RNA或蛋白质结合,在表观遗传、转录及转录后等水平调控基因表达。目前,lncRNA已经成为继mRNA、小RNA(microRNA、piRNA、 siRNA等)之后功能基因组学最火热的研究领域,但是绝大部分lncRNA的功能目前仍不清楚。

lncRNA测序采用Illumina HiSeq平台进行测序,针对有参考基因组样本开展准确的lncRNA鉴定和lncRNA靶基因预测,同时提供针对测序数据中mRNA的分析,结果更全面,广泛应用于医学、农学研究领域。

技术优势

  • 高覆盖度

新一代高通量测序技术的高深度覆盖,可检测未知基因,发现新的转录本,可以检测到低丰度的稀有转录本

  • 与mRNA进行关联分析

可以将lncRNA与mRNA关联分析,挖掘lncRNA可能的功能信息

应用方向

  • 实验流程

 

  • 生信分析

 

 

  • 产品参数
产品类型 平台 推荐数据量 周期
lncRNA测序 HiSeq X (PE 2*150) 2G/4G/6G clean data 45天
mRNA测序 HiSeq X (PE 2*150)  5M/10M/20M 30天

样本种类 单个样本量 注意事项
动物组织 >2 g 浓度:>25 ng/uL

纯度:OD(260/280)=1.8~2.0

血液样本 ≥2 mL
细胞样本 1×10^7个 25cm 塑料培养甁(5×10^6个)

75cm 塑料培养甁(2×10^7个)

RNA样品 ≥4 ug

≥10ng(微量建库)
浓度:>100 ng/uL

纯度:OD(260/280)=1.8~2.0

OD(260/230)≥2.0

RIN值≥6.5  28S:18S≥1.0

cDNA样品 ≥2 ug 浓度:>10 ng/uL

纯度:OD(260/280)=1.8~2.0

OD(260/230)≥2.0

RIN值≥6.5

1、样本数据统计

样本 Exp Con
文件名称 Exp_R1.fastq Exp_R2.fastq Con_R1.fastq Con_R2.fastq
文件类型 Conventional base calls Conventional base calls Conventional base calls Conventional base calls
Encoding Sanger / Illumina 1.9 Sanger / Illumina 1.9 Sanger / Illumina 1.9 Sanger / Illumina 1.9
总序列数量(条) 68500982 68500982 70349962 70349962
低质量序列(条) 0 0 0 0
序列长度(bp) 150 150 150 150
GC含量(%) 53 53 52 52

2、测序数据质量评估

测序数据质量评估内容包括:单碱基序列质量、序列质量分数、序列GC含量、序列长度分布。

A、单碱基序列质量:如果一条reads在某位置出错概率p=0.01时,图上纵坐标的值就是-10*log10(p)=20,红色表示中位数,黄色是25%-75%区间,触须是10%-90%区间,蓝线是平均数。

B、序列质量分数:横轴为质量,质量=-10*log10(p),其中p是一条reads在某位置出错概率;纵轴是reads数目。当峰值为27时代表错误率为0.2%,当峰值为20时代表错误率为1%)。

C、序列GC含量:红线是实际情况,蓝线是理论分布(正态分布,均值不一定在50%,而是由平均GC含量推断的)。

D、序列长度分布情况:横轴表示序列读长,纵轴表示序列数量。序列长度分布应该与测序理论值一致。

3、基础分析

基础分析包括:基因表达数据分析、聚类分析、转录本表达数据分析、转录本类型统计、差异基因功能分析、差异基因信号通路分析。

4、高级网络分析

高级网络分析包括:信号通路互作网络(Path-Net)、基因间信号转导网络(signal-Net)、lncRNA-Gene共表达网络(coexpression-Net)、转录因子调控网络(TF-Gene-Network)。

A、信号通路互作网络(Path-Net):描述信号通路与信号通路之间的上下游关系,能从网络中退出信号起始通路和效应通路。

B、基因间信号转导网络(signal-Net):展示基因间已被证实的上下游调控关系。

C、lncRNA-Gene共表达网络(coexpression-Net):根据基因表达值构建lncRNA与基因之间共表达网络,能发现新的基因之间的调控关系。

D、转录因子调控网络(TF-Gene-Network):展现调控目标基因的转录因子。

 

常见问题

1为什么lncRNA要测链特异性文库?
测序过程中保存了RNA方向信息,一方面可以使基因表达定量更为准确;另一方面能够准确区分转录本来自于基因组的哪条链,可以更好地鉴定antisense lncRNA。
2RNA测序与芯片方法对比有哪些优势?
 与芯片方法相比可以增加novel lncRNA的预测;另外还可选择特异富集的lncRNA。
3共表达分析需要多少样本?
最少6个(不包含生物学重复),如果想要准确度高的话最少15个(可包含生物学重复)。

 

联系咨询,请扫下方二维码!

发表评论

电子邮件地址不会被公开。 必填项已用*标注