lncRNA&mRNA测序
2017年3月9日
microRNA测序
2017年3月9日

mRNA测序

转录组测序采用Illumina高通量测序平台,对人特定组织或细胞在某个特定状态下转录的所有mRNA进行测序,与参考基因组比对,既可全面快速分析mRNA序列和丰度信息、又可对基因结构和产生的新转录本进行分析。

上海其明可为您提供全面的转录组学研究方案,强大的超级计算平台搭配经验丰富的的生信分析专家团队,可从实验方案设计到后期数据挖掘,全面助力您的科学研究。

技术优势

  • 无物种限制

无需了解物种的基因或基因组信息,便可直接对任意物种进行最全面的转录组分析。可检测未知基因,发现新的转录本。

  • 高精确度

数字化信号,可精确检测到基因家族中相似基因以及可变剪切造成的不同转录本的单碱基差异。

  • 高覆盖度

新一代高通量测序技术的高深度覆盖,可以检测到低丰度的稀有转录本

  • 流程

 

  • 生信分析

 

  • 产品参数
产品类型 平台 推荐数据量 周期
转录组测序 HiSeq X (PE 2*150) 2G/4G/6G clean data 30天

样本种类 单个样本量 注意事项
动物组织 >2 g 浓度:>25 ng/uL

纯度:OD(260/280)=1.8~2.0

血液样本 ≥2 mL
细胞样本 1×10^7个 25cm 塑料培养甁(5×10^6个)

75cm 塑料培养甁(2×10^7个)

RNA样品 ≥2 ug

≥10ng(微量建库)
浓度:>50 ng/uL

纯度:OD(260/280)=1.8~2.0

OD(260/230)≥2.0

RIN值≥6.5  28S:18S≥1.0

cDNA样品 ≥2 ug 浓度:>10 ng/uL

纯度:OD(260/280)=1.8~2.0

OD(260/230)≥2.0

RIN值≥6.5

 

1、样本数据统计

样本 Exp Con
文件名称 Exp_R1.fastq Exp_R2.fastq Con_R1.fastq Con_R2.fastq
文件类型 Conventional base calls Conventional base calls Conventional base calls Conventional base calls
Encoding Sanger / Illumina 1.9 Sanger / Illumina 1.9 Sanger / Illumina 1.9 Sanger / Illumina 1.9
总序列数量(条) 68500982 68500982 70349962 70349962
低质量序列(条) 0 0 0 0
序列长度(bp) 150 150 150 150
GC含量(%) 53 53 52 52

2、测序数据质量评估

测序数据质量评估内容包括:单碱基序列质量、序列质量分数、序列GC含量、序列长度分布。

A、单碱基序列质量:如果一条reads在某位置出错概率p=0.01时,图上纵坐标的值就是-10*log10(p)=20,红色表示中位数,黄色是25%-75%区间,触须是10%-90%区间,蓝线是平均数。

B、序列质量分数:横轴为质量,质量=-10*log10(p),其中p是一条reads在某位置出错概率;纵轴是reads数目。当峰值为27时代表错误率为0.2%,当峰值为20时代表错误率为1%)。

C、序列GC含量:红线是实际情况,蓝线是理论分布(正态分布,均值不一定在50%,而是由平均GC含量推断的)。

D、序列长度分布情况:横轴表示序列读长,纵轴表示序列数量。序列长度分布应该与测序理论值一致。

3、基础分析

基础分析包括:基因表达数据分析、聚类分析、转录本表达数据分析、差异基因功能分析、差异基因信号通路分析。

4、高级网络分析

高级网络分析包括:信号通路互作网络(Path-Net)、基因间信号转导网络(signal-Net)、基因共表达网络(coexpression-Net)、转录因子调控网络(TF-Gene-Network)。

A、信号通路互作网络(Path-Net):描述信号通路与信号通路之间的上下游关系,能从网络中退出信号起始通路和效应通路。

B、基因间信号转导网络(signal-Net):展示基因间已被证实的上下游调控关系。

C、基因共表达网络(coexpression-Net):根据基因表达值构建基因与基因之间共表达网络,能发现新的基因之间的调控关系。

D、转录因子调控网络(TF-Gene-Network):展现调控目标基因的转录因子。

 

常见问题

1转录组测序和DGE的关系是什么?
转录组和DGE主要的差别在于数据量和分析内容上,转录组的数据量较大,除了分析差异基因,还可以进行基因结构分析,而DGE就是数字基因表达谱,它的数据量较小,一般只分析差异基因,不能进行基因结构分析。
2如何确定研究物种有无参考基因组?
 根据所研究物种的拉丁文名,可在JGI(http://genome.jgi-psf.org/)、Ensembl(http://asia.ensembl.org/index.html)、NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索是否有该物种的基因组信息,也可在其他专门介绍某种物种的网站寻找参考基因组。 
3是否一定要求设置生物学重复以及重复次数?

目前没有生物学重复的实验发文章比较困难,尤其是IF≥5的杂志。文章投出之后,遭编辑质疑。如果确实受限于研究经费,无法设置生物学重复,那就得结合强有力的实验数据做支撑,比如定量实验、FISH荧光原位杂交或Northern blot等实验数据说服编辑。重复设置原则上越多越好,但是考虑到现实条件,重复设置≥3。一般不建议设置两个重复,因为如果两者结果不一致,我们无法确定以哪个数据为参考。

注:3个生物学重复,不等同于将3个样品的RNA等量混合后测序。3个样品等量混合测序,相当于将3个样本的基因表达量取平均值,其实就是相当于取了一个样本,由此得到的差异基因同样不可信,不能反应群体生物学现象。

4真核核糖体RNA去除的话,去除率一般多高?和原核转录组去核糖体RNA的方法一样吗?
   和原核去除核糖体的原理是一致的,现在去除真核生物rRNA的kit也主要是Ribozero公司的,针对特异物种。根据长期项目经验,绝大多数真核生物去除rRNA的效率大于90%。

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