microRNA测序
2017年3月9日
组蛋白修饰区域筛选
2017年3月9日

环状RNA测序

环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类特殊的非编码RNA,其具有很多重要的调控功能。circRNA可作为竞争性内源RNA(ceRNA)结合胞内miRNA阻断miRNA对其靶基因的抑制作用,还可调控其他类型RNA、调节蛋白质活性等。circRNA的环状结构对RNase不敏感,导致它比线性RNA更为稳定,这些特性使得circRNA具有开发疾病新型诊断与治疗方法的巨大潜力。

技术优势

  • 多物种选择

可直接对人、大鼠和小鼠样本进行最全面的circRNA分析,亦可发现新的circRNA(其他物种需特殊评估)。

  • 高精确度

数字化信号,可预测到基因家族中相似基因以及不同可变剪切类型产生的circRNA序列信息。

  • 高覆盖度

新一代高通量测序技术的高深度覆盖,可以检测到低丰度的稀有circRNA。

应用方向

 

  • 流程

 

  • 生信分析

 

  • 产品参数
产品类型 平台 推荐数据量 周期
CircRNA测序 HiSeq X (PE 2*150) 2G/4G/6G clean data 45天

样本种类 单个样本量 注意事项
动物组织 >2 g 浓度:>25 ng/uL

纯度:OD(260/280)=1.8~2.0

血液样本 ≥2 mL
细胞样本 1×10^7个 25cm 塑料培养甁(5×10^6个)

75cm 塑料培养甁(2×10^7个)

RNA样品 ≥10 ug 浓度:>200 ng/uL

纯度:OD(260/280)=1.8~2.0

OD(260/230)≥2.0

RIN值≥6.5  28S:18S≥1.0

cDNA样品 ≥2 ug 浓度:>10 ng/uL

纯度:OD(260/280)=1.8~2.0

OD(260/230)≥2.0

RIN值≥6.5

 

1、样本数据统计

样本 Exp Con
文件名称 Exp_R1.fastq Exp_R2.fastq Con_R1.fastq Con_R2.fastq
文件类型 Conventional base calls Conventional base calls Conventional base calls Conventional base calls
Encoding Sanger / Illumina 1.9 Sanger / Illumina 1.9 Sanger / Illumina 1.9 Sanger / Illumina 1.9
总序列数量(条) 68500982 68500982 70349962 70349962
低质量序列(条) 0 0 0 0
序列长度(bp) 150 150 150 150
GC含量(%) 53 53 52 52

2、测序数据质量评估

测序数据质量评估内容包括:单碱基序列质量、序列质量分数、序列GC含量、序列长度分布。

A、单碱基序列质量:如果一条reads在某位置出错概率p=0.01时,图上纵坐标的值就是-10*log10(p)=20,红色表示中位数,黄色是25%-75%区间,触须是10%-90%区间,蓝线是平均数。

B、序列质量分数:横轴为质量,质量=-10*log10(p),其中p是一条reads在某位置出错概率;纵轴是reads数目。当峰值为27时代表错误率为0.2%,当峰值为20时代表错误率为1%)。

C、序列GC含量:红线是实际情况,蓝线是理论分布(正态分布,均值不一定在50%,而是由平均GC含量推断的)。

D、序列长度分布情况:横轴表示序列读长,纵轴表示序列数量。序列长度分布应该与测序理论值一致。

3、基础分析

基础分析包括:circRNA表达数据分析、circRNA差异表达分析、聚类分析

4、高级网络分析

高级网络分析包括:microRNA与circRNA调控网络(microRNA-circRNA-Network)、circRNA与基因共表达网络(circRNA-mRNA-network)、ceRNA调控分析转录因子调控网络(TF- circRNA -Network)。

A、ceRNA调控网络分析:描述circRNA、miRNA、mRNA三者之间的相互调控关系。

B、circRNA与基因共表达网络(circRNA-mRNA-network):根据circRNA和基因在样本中的表达值构建circRNA与基因之间共表达网络,能发现circRNA所调控的靶基因。

C、转录因子调控网络(TF-circRNA-Network):展现调控目标circRNA的转录因子。

D、miRNA与circRNA调控网络:根据miRNA与circRNA靶向结合关系所构建的互相调控网络,能发现调控能力最强的circRNA以及其对应的靶向miRNA。

 

常见问题

1用芯片技术和用二代测序技术分析circRNA有什么区别?
芯片技术只能检测已知的circRNA,而且噪音信号比较大,现在对circRNA的研究相对较少,对circRNA的注释不全面;另外,circRNA的表达具有很强的时空特异性,我们又难以保证实验处理条件下获得的数据和数据库中收录的数据吻合,因此可能丢失大量特异表达的circRNA;二代测序技术使用先进软件对样本中circRNA进行筛选,不仅能分析已知的circRNA,更能获得新的circRNA,进一步丰富对circRNA的研究。
2circRNA过表达构建载体有哪些需要注意的?
构建circRNA载体需要有成环序列,还要有必要的促进成环序列,如长的临近序列。
3去除rRNA链特异性建库,与去除rRNA线性消化链特异性建库的优缺点?

(1)去除核糖体,构建去rRNA文库,在此基础上使用生物信息学方法预测circRNA

优点:不需要使用RNase R减少部分实验消耗,可以同时研究mRNA, lncRNA, circRNA。

缺点:只能研究部分高表达的circRNA,无法大规模检测,需要较高的测序数据量准确度差。

(2)去除核糖体,使用RNase R去除线性RNA

优点:circRNA检出量高, 是第一种方案的20倍circRNA鉴定准确度高。

缺点:由于消除了线性RNA,mRNA,lncRNA与circRNA表达水平将会失真。

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