组蛋白修饰区域筛选

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组蛋白修饰区域筛选

染色质免疫共沉淀—高通量测序(ChIP-seq)采用特异性抗体对目的蛋白进行免疫沉淀后,分离与其结合的基因组DNA片段,并通过高通量测序,在全基因组范围内寻找目的蛋白特异结合的DNA位点,且可基于多个样品进行差异比较分析及特异蛋白结合位点的序列偏好性分析。

应用方向

  • 实验流程

  • 生信分析

  • 产品参数
产品类型 平台 推荐数据量 周期
Chip-seq HiSeq X (PE 2*150) 组蛋白修饰≥20M

非组蛋白修饰≥10M

45天

样本 样本总量 注意事项
DNA >20 ng 浓度>1 ng/uL

纯度:OD(260/280)=1.8~2.0

 

常见问题

1Input和IP样本之间的关系是什么?
Input和IP属于两个样本,在前期检测、建库、测序都是平行进行的,但是分析中需要将两个样本的测序数据进行整合分析,得出最终的peak结果,并进行后续分析。
2Input是什么?有什么作用?
我们将DNA或者RNA片段化后,在进行免疫沉淀前,需要取一部分断裂后的染色质做Input对照(不进行免疫沉淀过程)。Input是断裂后的基因组DNA或者RNA,需要与沉淀后的样品DNA/RNA一起经过逆转交联,DNA/RNA纯化,以及最后的PCR或其他方法检测。通过后续数据分析,我们可以通过Input对照排除背景噪音(排除因本底表达水平高或一些非特异性结合所造成的假阳性peaks),验证染色质断裂的效果和整个实验中IP效果,所以Input对照是IP-seq实验必不可少的步骤。
3阳性对照和阴性对照是什么?

阳性对照

一般用anti-RNA polymerase II抗体,因为RNA polymerase II是通用转录因子,在所有细胞中都能结合基因的核心启动子区,因此理论上,ChIP后PCR会有条带。一般阳性对照不进行测序。

阴性对照

阴性对照分为mock和Input两种,二者均能起到减少假阳性的作用。mock:用普通IgG为抗体,理论上不会ChIP下来任何DNA片段,因此作为阴性对照,但是由于非特异性结合,或者实验过程,没发生结合的DNA清楚不完全,可能会出现条带,但是一般条带亮度较弱。IgG不需要进行测序,只是判断IP试验中所选取的抗体是否特异。

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